На правах рукописи
14.01.24 – трансплантология и искусственные органы
14.03.02 – патологическая анатомия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
Москва 2012
Научные руководители:
доктор медицинских наук | Цирульникова Ольга Мартеновна |
доктор медицинских наук, профессор | Ильинский Игорь Михайлович |
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор | Рябоштанова Елена Ивановна |
доктор медицинских наук, профессор | Чжао Алексей Владимирович |
Ведущее учреждение:
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова" Минздравсоцразвития РФ.
Актуальность темы. В настоящее время трансплантация печени в России осуществляется в 11 трансплантологических Центрах и составляет от 1 до 1,5 трансплантаций на 1 млн. населения в 2009-2010 гг. (С.В. Готье, 2011). В то же время потребность в пересадке печени ежегодно возникает у 10-20 человек на 1 млн. (Е.Б. Ярошенко с соавт., 2010). Очевидно, что столь низкие показатели выполняемых в год трансплантаций не удовлетворяют существующие потребности.
На пути расширения донорского пула при изъятии печени были пересмотрены допустимые критерии донора и приняты так называемые "расширенные критерии" (С.В. Готье с соавт., 2008; Я.Г. Мойсюк с соавт., 2010; M. Gastaca, 2009; H.M. Noujaim et al., 2009), включающие: возраст донора старше 50 лет, пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) более семи суток, острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) как причина смерти, высокий уровень инотропной поддержки (дофамин более 15 мкг/кг/мин), патологическое ожирение (индекс массы тела более 30 кг/рост, м2), наличие вирусной и бактериальной инфекций, натрий сыворотки крови более 160 ммоль/л, время холодовой ишемии более 15 часов и гистологические признаки жирового гепатоза (более 50%). Использование "расширенных критериев" позволило увеличить количество выполняемых трансплантаций, однако привело к повышению риска операций из-за неудовлетворительного качества донорских органов (В.Е. Загайнов с соавт., 2009; М.Г. Минина с соавт., 2010; R.S. Mangus et al., 2010; J.C. Lai et al., 2011).
Данный факт определяет особое значение морфологической экспрессдиагностики печени потенциального посмертного донора, которая могла бы предоставить объективную информацию о состоянии органа в кратчайшие сроки (M.I. Minervini et al., 2009; J.H. Lefkowitch, 2010). Однако данных о патогистологических критериях при морфологическом определении пригодности печени для трансплантации в литературе не представлено.
В раннем послеоперационном периоде основной патологией, влияющей на начальную функцию трансплантированной печени, является ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение (ИКРП). Тяжёлая степень ИКРП трансплантата сопровождается потерей его функции почти у 50% пациентов (С.В. Готье с соавт., 2008). На сегодняшний день ишемическое повреждение трансплантированной печени клинически оценивают в соответствии с разработанной шкалой выраженности цитолиза (О.М. Цирульникова, 2004). В то же время вопросы морфологии ИКРП трансплантированной печени изучены не достаточно. Имеющиеся немногочисленные публикации по данной теме (Б.А. Константинов с соавт., 1996; Н.Н. Бабенко с соавт., 2004; М.М. Морозова с соавт., 2005; S.A. Geller, L.M. Petrovic, 2004; F. Kalantari et al., 2007) не однозначны в интерпретации и не содержат чётких морфологических критериев ИКРП по степени тяжести, что предполагает дальнейшие исследования в данном направлении. Все эти вопросы определили цель и задачи данного исследования.
Цель исследования: разработка патогистологических критериев оценки донорской печени и изучение морфологии ишемического консервационнореперфузионного повреждения трансплантированной печени.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Научная новизна исследования. Впервые в сравнительном аспекте изучены основные клинико-лабораторные показатели у эффективных (ЭД) и неэффективных (НД) посмертных доноров печени.
Впервые изучены морфологические и иммуногистохимические изменения в печени у ЭД и НД; определены патогистологические критерии оценки донорской печени; и разработан протокол, позволяющий охарактеризовать имеющиеся изменения в баллах. Показана значимость экспресс-биопсии печени у потенциальных посмертных доноров при комплексной оценке пригодности органа для трансплантации.
Впервые разработаны морфологические критерии оценки различной степени тяжести ИКРП в трансплантированной печени.
Практическая ценность исследования. Комплексная оценка ряда клинико-лабораторных показателей (индекса массы тела; уровней АСТ, АЛТ, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; дозы вазопрессоров, применяемой для инотропной поддержки; а также показателей ЦВД и систолического АД на момент собственно констатации смерти мозга) может быть использована в качестве объективного критерия при отборе потенциальных посмертных доноров печени.
При морфологическом определении пригодности донорской печени для трансплантации кроме стеатоза и фиброза могут быть использованы и другие значимые критерии (белковая дистрофия и некроз гепатоцитов; эндотелиит центральных вен, эндартериит, флебит и воспалительная инфильтрация в портальных трактах). При этом адекватная комплексная оценка пригодности органа для трансплантации не возможна без гистологического исследования экспресс-биоптата печени потенциального посмертного донора.
Морфологическая градация ИКРП трансплантированной печени с разделением его на три степени может применяться при гистологическом исследовании биоптатов печени в раннем пострансплантационном периоде.
Положения, выносимые на защиту.
Реализация результатов исследования. Результаты исследования нашли клиническое применение в отделениях пересадки почки и печени, абдоминальной хирургии и трансплантации ФГБУ ФНЦТиИО МЗиСР РФ, а также в хирургическом отделении трансплантации органов ФБУЗ ПОМЦ ФМБА России. Основные результаты исследования включены в программу обучения студентов старшего курса лечебного факультета кафедры "Трансплантология и искусственные органы" Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.
Апробация работы. Материалы и основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции "Трансплантация печени в России: 20 лет спустя" - Москва (2010), III Международной научно-практической конференции "Высокие технологии в медицине" - Нижний Новгород (2010), V Всероссийском Съезде по трансплантологии и искусственным органам – Москва (2010), совместной научно-практической конференции отделений и лабораторий "ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова" Минздравсоцразвития РФ – 27.10.2011 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объём и структура работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы, четырёх глав (обзор литературы, материал и методы исследования, две главы собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы и трёх приложений. Работа изложена на 146 страницах машинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 60 рисунками. Список литературы включает 75 названий на русском и 151 на иностранных языках.
Материал исследования. Проведено ретроспективное гистологическое исследование 35 биоптатов печени от потенциальных мультиорганных доноров со смертью мозга и 29 биоптатов трансплантированной печени в раннем послеоперационном периоде из ФГБУ ФНЦТИО им. В.И. Шумакова МЗиСР РФ, а также 25 экспресс-биоптатов печени от потенциальных мультиорганных доноров со смертью мозга из Приволжского Координационного Центра органного и тканевого донорства (ПКЦОД). Анализируемый период с 2004 по 2011 гг.
Методы исследования.
Оценка клинико-лабораторных показателей включает анализ данных паспорта трупной печени, материала историй болезни и индивидуальных карт реципиентов.
Гистологические методы. Образцы биоптатов ткани печени фиксировали в 10% забуференном формалине (pH 6,8-7), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 4 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином, трихромом по Массону с анилиновым синим и проведением PAS-реакции. В 25 наблюдениях (экспресс-биопсии печени потенциальных посмертных доноров из ПКЦОД) использовали замороженные гистологические срезы, полученные с помощью криостата Thermo scientific Microm HM 525.
Иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) проводили модифицированным непрямым иммунопероксидазным методом (А.П. Киясов, 2004) с восстановлением антигенной специфичности путём воздействия на ткань нагреванием на водяной бане. Для ИГХИ использовали моноклональные антитела: CD3 клон LN10 (Novocastra), CD20 клон L26 (Dako), CD15 клон ММА (Cell Marque) и CD68 клон Кр-1 (Cell Marque). Иммуногистохимически определяли клеточный состав воспалительного инфильтрата в портальных трактах и паренхиме печени у потенциальных посмертных доноров: Т- и В-лимфоциты - по экспрессии CD3 и CD20, полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - по экспрессии CD15, клетки Купфера - по экспрессии CD68.
Морфометрический метод. Подсчёт количества гепатоцитов в состоянии стеатоза, белковой дистрофии, некроза и холестаза; количества Т- и В-лимфоцитов, ПМЯЛ и клеток Купфера в каждом биоптате печени потенциального посмертного донора проводили при помощи автоматизированной системы ImageScope M и микроскопа Leica DM 5000. Результат выражали в процентах.
Статистический метод. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью лицензионной программы "STATISTICA/W", программного обеспечения StatEx-2004.2, электронных таблиц Excel. Данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение (M±σ). Большинство исследуемых в работе показателей не отвечало требованиям нормального распределения, поэтому статистическую обработку проводили методами непараметрической статистики с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Корреляционные связи между признаками изучали при помощи критерия Пирсона (r). Достоверность различий оценивали по критерию p (статистически значимыми считали значения p < 0,05).
Результаты исследования клинико-лабораторных показателей у посмертных доноров печени. Проведено исследование клинико-лабораторных показателей у 60 мультиорганных доноров со смертью мозга (41 – мужчины, 19 – женщины) в возрасте от 19 до 69 лет (средний возраст 45,73±12,55 года). Причиной смерти у 37 человек было острое нарушение мозгового кровообращения, у 23 – черепно-мозговая травма. Потенциальные посмертные доноры печени были разделены на две подгруппы: эффективные (ЭД) – 30 и неэффективные (НД) – 30. Подгруппы НД и ЭД сформированы с минимальными различиями (p>0,05) по возрасту, полу и причине смерти. В проведённом исследовании длительность искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) во всех наблюдениях совпадала с длительностью пребывания в ОРИТ и не превышала семи суток. При сравнении индекса массы тела (ИМТ) между подгруппами НД и ЭД получено статистически достоверное (p<0,001) различие. ИМТ в подгруппе НД у трёх (10%) соответствовал нормальным значениям (до 24,99 кг/м2); у 27 (90%) отмечали ожирение различной степени: I степени (ИМТ 25-29,99 кг/м2) – у 13 (43,3%), II степени (ИМТ 30-34,99 кг/м2) - у 10 (33,3%), III степени (ИМТ 35 кг/м2 и выше) – у четырёх (13,4%). У восьми (26,7%) НД был алкогольный анамнез с выявлением маркёров алкогольного поражения печени при гистологическом исследовании. У ЭД самый высокий показатель ИМТ превысил верхнюю границу нормы на 32,4% и составил 33,1 кг/рост, м2, не было ожирения III степени и алкогольного анамнеза.
При сравнении основных лабораторных показателей у НД по сравнению с ЭД выявлены достоверно выше уровни трансаминаз (p<0,001), общего билирубина (p=0,006) и натрия (p=0,009) в сыворотке крови. При этом у НД в пяти (17%) наблюдениях АСТ и в двух (7%) АЛТ - превышали пять норм, в восьми (27%) - общий билирубин соответствовал трём нормам. У ЭД указанные показатели не выходили за рамки двух норм. У НД в 19 (63,3%) наблюдениях уровень натрия в сыворотке крови составил от 164 до 189 ммоль/л (в среднем 176,37±9,69 ммоль/л), из них у десяти (34%) – был выше 180 ммоль/л (в среднем 184,8±3,26 ммоль/л). У 11 (36,7%) НД уровень натрия в сыворотке крови не превышал 160 ммоль/л (в среднем 141,91±15,97 ммоль/л). У ЭД в пяти (16,7%) наблюдениях уровень натрия в сыворотке крови составил от 163 до 171 ммоль/л (в среднем 166,6±4,04 ммоль/л), у 25 (83,3%) – не превышал 160 ммоль/л (в среднем 146,24±7,61 ммоль/л).
При сравнении основных показателей гемодинамики между НД и ЭД на момент начала процедуры констатации смерти мозга, совпадающей с разъединительным тестом, достоверных различий не отмечено (p>0,05). У НД и ЭД в периоде кондиционирования применяли инотропную поддержку с использованием различных препаратов: в 36 (60%) наблюдениях - дофамином, в восьми (13,3%) - дофамином в комбинации с адреналином, в четырёх (6,7%) – дофамином в комбинации с мезатоном. В 11 (18,3%) наблюдениях применяли только адреналин. У одного (1,7%) НД использовали комбинацию мезатона и адреналина на фоне травматического шока крайней степени тяжести. Для стабилизации состояния НД потребовалось применить большую дозу вазопрессоров (дофамина) по сравнению с ЭД (p=0,006). На момент собственно констатации смерти мозга, в результате проводимой терапии, состояние доноров в обеих исследуемых подгруппах удавалось стабилизировать; получены достоверные различия по показателям ЦВД (p=0,027) и систолического АД (p=0,03) между НД и ЭД.
Результаты гистологического исследования печени у потенциальных посмертных доноров. Проведено гистологическое исследование инцизионных биоптатов печени у 30 НД и 30 ЭД. Все биопсии были выполнены до перфузии (при сохранённом кровотоке). На основании собственного опыта был выбран блок морфологических параметров, включающий оценку: стеатоза, белковой дистрофии, некроза и холестаза гепатоцитов; степени флебита, эндартериита, воспалительной инфильтрации и фиброза стенок печёночных артерий в портальных трактах; степени эндотелиита в центральных венах; стадии фиброза в печени.
В подгруппе НД процент стеатоза, белковой дистрофии и некроза гепатоцитов были достоверно (p<0,001) выше по сравнению с подгруппой ЭД. Стеатоз в печени у НД и ЭД всегда был смешанным (макро- и микровезикулярным) и в изолированной виде не наблюдался. Однако у НД прослеживали тенденцию к преобладанию акровезикулярного стеатоза. Белковая дистрофия гепатоцитов у ЭД в 28 (93%) наблюдениях была очаговой, в двух (7%) – диффузной; у НД в 21 (70%) наблюдении - диффузной вплоть до гидропической, в девяти (30%) – очаговой. Некроз гепатоцитов у ЭД отметили в 10 (33,3%) наблюдениях в виде единичных некротизированных клеток или моноцеллюлярных некрозов; у НД - в 24 (80%) биоптатах печени в виде моноцеллюлярных или центролобулярных некрозов. При сравнении холестаза между подгруппами НД и ЭД значимых различий не выявлено (p=0,9).
Для характеристики в печени посмертных доноров ряда гистологических показателей (степени флебита, эндартериита, воспалительной инфильтрации и фиброза стенки печёночных артерий в портальных трактах; а также степени эндотелиита в центральных венах) была разработана морфологическая шкала, на основании которой указанные показатели были определены полуколичественно в баллах от 0 до 3 (отсутствие, лёгкий, умеренный, тяжёлый). У НД по сравнению с ЭД достоверно выше были: степень воспалительной инфильтрации (p<0,001), степень флебита и эндартериита в портальных трактах (p=0,03); степень эндотелиита в центральных венах (p=0,026). Фиброз стенки печёночных артерий в обеих исследуемых подгруппах доноров встречали редко; при статистической обработке результатов достоверных различий между НД и ЭД по данному показателю не выявлено (p=0,5).
В обеих исследуемых подгруппах доноров выявили прямо пропорциональную зависимость: степени воспалительной инфильтрации в портальных трактах от степени флебита и эндартериита в портальных трактах (у НД r=0,5, p=0,006; у ЭД r=0,6, p<0,001); степени воспалительной инфильтрации в портальных трактах от степени эндотелиита в центральных венах (у НД r=0,54, p=0,002; у ЭД r=0,8, p<0,001).
Для оценки фиброза в биоптатах печени у ЭД и НД использовали систему METAVIR, так как она считается наиболее достоверной и воспроизводимой (Т.П. Некрасова, 2007). У НД стадия фиброза печени была достоверно (p<0,001) выше по сравнению с ЭД.
Результаты иммуногистохимического исследования. В воспалительных инфильтратах портальных трактов доноров исследуемых подгрупп преобладали Т-лимфоциты, их количество у НД по сравнению с ЭД было статистически достоверно (p<0,001) выше. В-лимфоциты в портальных трактах НД и ЭД встречали в виде единичных клеток. Количество ПМЯЛ в паренхиме печени ЭД и НД статистически значимо не различалось (p=0,5). Количество клеток Купфера в паренхиме печени у НД было достоверно (p<0,001) выше по сравнению с ЭД.
Протокол морфологической оценки печени посмертного донора создан на основании разработанных патогистологических критериев, выраженных в баллах; позволяет при комплексном суммировании баллов определить патологию донорской печени: сумма баллов от 0 до 10 - патология лёгкой степени, от 11 до 15 – умеренной и от 16 до 25 – тяжёлой (табл. 1).
Таблица 1. Протокол морфологической оценки печени посмертного донора.
№ п/п | Морфологические признаки | Балл | Критерии |
1
| Стеатоз гепатоцитов (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | 1 степень (до 33%) | ||
2 | 2 степень (до 66%) | ||
3 | 3 с тепень (более 66%) | ||
2
| Белковая дистрофия гепатоцитов (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | лёгкой степени (очаговая) | ||
2 | умеренной степени (очагово-диффузная) | ||
3 | тяжёлой степени (диффузная гидропическая) | ||
3
| Некроз гепатоцитов (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | единичные клетки | ||
2 | очаговый | ||
3 | обширный центролобулярный | ||
4
| Эндотелиит центральных вен (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения вены) | ||
2 | тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения вены) | ||
3 | некроз стенки центральной вены и/или трансмуральный эндотелиит | ||
5
| Фиброз портальных трактов (0-4 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | F1 | ||
2 | F2 | ||
3 | F3 | ||
4 | F4 | ||
6
| Воспалительная инфильтрация в портальных трактах (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | лёгкой степени (преимущественно лимфоцитарное воспаление в меньшей части триад) | ||
2 | умеренной степени (смешанный воспалительный инфильтрат из лимфоцитов, ПМЯЛ в большей части триад) | ||
3 | тяжёлой степени (то же, что для умеренной степени, с вовлечением перипортальных зон) | ||
7
| Эндартериит в портальных трактах (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения артерии) | ||
2 | тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения артерии) | ||
3 | некроз стенки печёночной артерии и/или трансмуральный эндартериит с некрозом стенки | ||
8
| Флебит в портальных трактах (0-3 балла)
| 0 | отсутствует |
1 | лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения вены) | ||
2 | тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения вены) | ||
3 | некроз стенки печёночной вены и/или трансмуральный флебит |
Целью разработки протокола морфологической оценки печени посмертных доноров явилось не только создание единой схемы описания патологических изменений в биоптатах. Мы стремились к тому, чтобы критерии, получающие наивысший балл, обладали прогностической значимостью при использовании общего подхода, и чтобы протокол был достаточно гибким для будущих дополнений.
Анализ 16 наблюдений из ПКЦОД показал, что при трансплантации с патологией в донорской печени умеренной и тяжёлой степени, у реципиентов в раннем посттрансплантационном периоде существует высокий риск развития умеренного и тяжёлого ИКРП в трансплантате. При наличии у донора патологии лёгкой степени (n=3) наблюдали лёгкое ИКРП; при патологии умеренной степени (n=11) – у девяти реципиентов отмечали умеренное ИКРП, у двух – тяжёлое ИКРП; при патологии тяжёлой степени (n=2) – тяжёлое ИКРП. Во всех наблюдениях (n=16): время холодовой ишемии составило 378,75±120,78 мин.; ОТП была выполнена по методике piggy back; веновенозный обход не применялся; время агепатического периода 57±3,74 мин.; время тепловой ишемии 35±11,69 мин.; появление жёлчи после пуска кровотока – во всех случаях; холедохо-холедохоанастомоз – во всех случаях; общее время операции 248,13±38,68 мин.; кровопотеря 965,63±471,42 мл. Ранний послеоперационный период по клинико-лабораторным данным (без морфологического подтверждения результатами одночасовой биопсии) у всех реципиентов сопровождался развитием ИКРП различной степени.
В проведённом исследовании (n=16) не выявлено статистически достоверной зависимости выраженности синдромов цитолиза и холестаза у реципиентов от уровней показателей трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови у ЭД (r=0,1-0,21; p>0,05). Однако, между лабораторными показателями реципиентов и морфологическими изменениями в печени ЭД, получены достоверно значимые прямые корреляции: уровень ЩФ (r=0,25; p<0,001) и общего билирубина (r=0,31; p<0,001) в сыворотке крови реципиентов статистически достоверно коррелировал с выраженностью холестаза в печени ЭД; уровень показателей АСТ, АЛТ, ЛДГ и γ-ГТП (r=0,64-0,67; p<0,001) у реципиентов – с инфильтрацией ПМЯЛ в печёночной дольке и стенках центральных вен у ЭД; умеренное ИКРП (r=0,62, p=0,01) у реципиентов - с лёгкой степенью воспалительной инфильтрации в портальных трактах печени у ЭД; тяжёлое ИКРП (r=0,63, p=0,02) у реципиентов – с умеренной степенью воспалительной инфильтрации в портальных трактах печени у ЭД.
Результаты исследования корреляционных связей между клиническими и морфологическими показателями у потенциальных посмертных доноров печени. У НД выраженность стеатоза в печени прямо пропорционально зависела от ИМТ донора (r=0,9, p<0,001). Так как у ЭД значения ИМТ были приближены к норме, а стеатоз в печени не превышал 30%, взаимосвязь между стеатозом и ИМТ оказалась не достоверной (r=0,2, p=0,3).
Изучение в подгруппах НД и ЭД зависимости ряда других клинико-лабораторных показателей (уровня трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; а также длительности ИВЛ) от выраженности морфологических изменений в печени (стеатоза, белковой дистрофии и некроза гепатоцитов; степени выраженности воспалительных изменений в портальных трактах и стенках сосудов) показало статистически не достоверную взаимосвязь (r=0,1-0,2, p>0,05). Полученные результаты, вероятно, обусловлены тем, что морфологические изменения в печени приводят к развитию комплекса клинико-лабораторных изменений, а не отдельно взятого клинико-лабораторного показателя; а также небольшим количеством наблюдений.
По паспорту трупной печени у НД проанализированы причины отказа от трансплантатов. В семи (23,4%) наблюдениях причиной отказа послужило сочетание нестабильной гемодинамики, гипернатриемии и возраста донора старше 60 лет с необходимостью применения высоких доз вазопрессоров и неудовлетворительной визуальной оценкой трансплантата. Указанные факторы многие исследователи (M. Ravaioli et al., 2009; G.A. Franklin et al., 2010) рассматривают в качестве неблагоприятных для выживаемости трансплантата. В одном (3,2%) наблюдении диагностирована почечно-клеточная карцинома; в двух (6,7%) – гепатит С, что является противопоказанием для трансплантации (Р. Розенталь, 2005). Однако в 20 (66,7%) наблюдениях в качестве причины отказа от трансплантатов печени указывалась неудовлетворительная оценка органа по данным визуального осмотра и ультразвукового исследования (УЗИ).
В 25 наблюдениях из ПКЦОД выполняли экспресс-биопсию органа до перфузии; гистологическое заключение выдавали в течение 20 мин. с момента поступления материала в патологоанатомическое отделение; сопоставляли с данными визуальной оценки и УЗИ печени; учитывали в принятии решения о пригодности органа для трансплантации. У трёх (12%) доноров по данным УЗИ определили резко повышенную эхогенность печени и не рекомендовали органы для трансплантации. Однако при гистологическом исследовании экспресс-биоптатов печени патология у данных доноров соответствовала умеренной степени (11-12 баллов) с очагово-диффузной белковой дистрофией и стеатозом до 20%. По результатам экспресс-биопсий органы были определены как пригодные для трансплантации.
Заключение
Подгруппы НД и ЭД статистически достоверно (p<0,05) различались по ряду клинико-лабораторных (ИМТ; уровню трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; дозе дофамина, используемой для инотропной поддержки, показателям систолического АД и ЦВД на момент собственно констатации смерти мозга) и морфологических (стеатозу, белковой дистрофии и некрозу гепатоцитов; фиброзу в печени; эндотелииту в центральных венах; эндартерииту, флебиту и воспалительной инфильтрации в портальных трактах) показателей. ЭД в отличие от НД по всем параметрам находились в рамках установленных "расширенных критериев". Морфологическое и ИГХИ исследования показали, что у доноров обеих исследуемых подгрупп в печени имелись хронические воспалительные изменения, что может быть связано с перенесённым в течение жизни субклиническим неспецифическим гепатитом, реакцией на лекарственные препараты, аллергены и т.д. В то же время, в печени у НД, по сравнению с ЭД, отмечалась более высокая воспалительная активность (p<0,001). Определены статистически значимые патогистологические критерии для оценки печени посмертного донора и разработан протокол, позволяющий не только определить патологию донорской печени в баллах, но и с высокой долей вероятности прогнозировать степень тяжести ИКРП в раннем посттрансплантационном периоде. У НД установлена достоверная корреляционная связь (r=0,86, p<0,001) между ИМТ и стеатозом в печени, что предполагает использовать показатель ИМТ донора для прогнозирования выраженности стеатоза в печени при комплексной оценке пригодности органа для трансплантации. Морфологическое исследование экспрессбиоптатов печени у ЭД и НД показало, что предоставляемая информация о состоянии органа является объективной, уточняет и дополняет данные визуальной оценки и УЗИ.
Проведено гистологическое исследование 29 биоптатов трансплантированной печени от 26 реципиентов в возрасте от 27 до 62 лет (средний возраст 43,33 ± 1,84 года; 14 - мужчин, 12 - женщин). Среди исследованных биопсий одночасовые составили 22 (76%); биопсии, взятые на вторые и третьи сутки после операции – три (10,3%); на седьмые – три (10,3%); на 11 – одна (3,4%). У 23 реципиентов биопсия бралась один раз; у трёх - два раза.
При морфологическом исследовании биоптатов трансплантированной печени во всех наблюдениях отмечали микроциркуляторные нарушения, дистрофию и некроз гепатоцитов, признаки вакуолизации цитоплазмы и ядер гепатоцитов, неравномерное распределение гликогена в цитоплазме гепатоцитов. Повреждение в большей степени касалось перивенулярных зон ацинусов печени.
В зависимости от выраженности морфологических изменений, биоптаты были распределены по гистологическому диагнозу: ИКРП лёгкой степени - 10 (34,5%), умеренной – 10 (34,5%), тяжёлой – девять (31%).
Биоптаты с ИКРП лёгкой степени (n=10) были получены через один час и на седьмые сутки после операции (протокольная биопсия); ранний послеоперационный период протекал гладко; устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов отмечали к 14 суткам после ОТП. Морфологические изменения были незначительными и, преимущественно, выражались в виде нарушений в микроциркуляторном русле.
Биоптаты с ИКРП умеренной степени (n=10) были получены через один час и на 11 сутки после операции; в раннем послеоперационном периоде с первых суток во всех наблюдениях отмечали дисфункцию трансплантата, что потребовало у трёх реципиентов проведения нескольких сеансов молекулярной адсорбирующей рециркулирующей системы (МАРС-терапия) для лечения печёночной недостаточности, у одного - нескольких сеансов гемодиафильтрации с целью купирования почечной недостаточности; устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов у девяти реципиентов этой подгруппы отмечали к 15-20 суткам после ОТП. Умерла одна пациентка на 20 сутки после ретрансплантации. Причиной смерти послужило развитие тяжёлого инфекционного поражения сочетанного генеза бактериальное, вирусное и грибковое) на фоне тяжёлой дисфункции двух трансплантатов (больной была выполнена ретрансплантация на 20-е сутки) в условиях массивной иммуносупрессии. Гистологически, в отличие от ИКРП лёгкой степени, белковая дистрофия приобретала характер гидропической, макро- и микровезикулярный стеатоз наблюдали во всех зонах ацинусов, отмечали моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов, умеренно выраженную лимфоцитарную и нейтрофильную инфильтрацию, умеренный и тяжёлый центральный эндотелиит.
Биоптаты с ИКРП тяжёлой степени (n=9) были получены через один час, на вторые, третьи и седьмые сутки после операции; в раннем послеоперационном периоде во всех наблюдениях с первых суток отмечали дисфункцию трансплантата, что потребовало медикаментозной коррекции. Устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов у восьми реципиентов этой подгруппы отмечали к 15-34 суткам после ОТП. Умерла одна больная на 30 сутки после операции. Причиной смерти послужило развитие развёрнутого синдрома полиорганной недостаточности (энцефалопатия, острая сердечно-сосудистая недостаточность, острая печёночно-почечная недостаточность, коагулопатия), нижнедолевой правосторонней пневмонии и инфекционно-токсического шока на фоне тяжёлой дисфункции трансплантата печени. Морфологические изменения при ИКРП тяжёлой степени характеризовались: дискомплексацией печёночных балок, диффузной гидропической дистрофией гепатоцитов, отёком и кровоизлияниями в паренхиме печени, очаговым и диффузным макровезикулярным стеатозом во всех зонах ацинусов, моноцеллюлярными и центролобулярными некрозами гепатоцитов, диффузным расширением пространств Диссе с полнокровием синусоидов, диффузной инфильтрацией ПМЯЛ в портальных трактах и паренхиме печени; тяжёлым центральным эндотелиитом.
Данные по времени холодовой и тепловой ишемии, а также агепатического периода в ходе ОТП у реципиентов с различной степенью ИКРП представлены в таблице 2.
Таблица 2. Продолжительность холодовой и тепловой ишемии; агепатического периода в ходе ортотопической трансплантации печени у реципиентов с различной степенью ишемического консервационно-реперфузионного повреждения (M±σ).
Показатели (мин.) | Ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение | ||
Лёгкая степень (n=10) | Умеренная степень (n=10) | Тяжёлая степень (n=9) | |
Холодовая ишемия | 416,6 ± 52,96 430,0 [330 - 470] | 504,8 ± 95,14 537,0 [388 - 630] | 439,44 ± 48,25 460,0 [330 - 475] |
Тепловая ишемия | 45,6 ± 7,79 45,0 [36 - 57] | 42,5 ± 2,55 42,0 [40 - 48] | 45,67 ± 5,29 44,0 [40 - 55] |
Агепатический период | 53,4 ± 12,43 52,0 [40 - 70] | 57,8 ± 2,2 58,0 [55 - 60] | 82,67 ± 17,85 78,0 [75 - 130] |
На момент взятия биопсии у всех реципиентов исследуемой группы отмечали повышение активности АСТ, АЛТ и ЛДГ в сыворотке крови (табл. 3).
Таблица 3. Показатели АСТ, АЛТ, ЛДГ при различной степени ишемического консервационно-реперфузионного повреждения трансплантата печени (M±σ).
Ферменты | Ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение | ||
Лёгкая cтепень (n=10) | Умеренная степень (n=10) | Тяжёлая cтепень (n=9) | |
АСТ, Ед/л | 842,4 ± 74,44 | 2651,2 ± 223,06 | 4890,33 ± 1214,31 |
АЛТ, Ед/л | 508,3 ± 126,83 | 1171,14 ± 246,22 | 2012,22 ± 691,96 |
ЛДГ, Ед/л | 854,25 ± 69,07 | 3507,4 ± 503,22 | 8952,14 ± 1364,09 |
Различия по показателям АСТ, АЛТ и ЛДГ между подгруппами с различной степенью ИКРП (лёгкой / умеренной, лёгкой / тяжёлой и умеренной / тяжёлой) статистически достоверные (p≤0,01). Выраженность цитолитического синдрома оказалась прямо пропорциональной степени ИКРП трансплантата печени, что соответствует данным литературы (О.М. Цирульникова, 2004; С.В. Готье с соавт., 2008) и подтверждает продемонстрированные выше результаты морфологического исследования. Установлена достоверная прямая корреляционная связь повышения активности АСТ (r=0,93, p<0,001), АЛТ (r=0,84, p<0,001) и ЛДГ (r=0,95, p<0,001) от глубины повреждения органа.
В результате проведённого исследования были разработаны морфологические критерии лёгкого, умеренного и тяжёлого ИКРП (табл. 4).
Таблица 4. Морфологические критерии лёгкой, умеренной и тяжёлой степени ишемического консервационно-реперфузионного повреждения трансплантированной печени.
Лабораторно-морфологические критерии | Лёгкая степень | Умеренная степень | Тяжёлая степень |
АСТ (Ед/л) | до 1000 | свыше 1000 до 3000 | более 3000 |
АЛТ (Ед/л) | до 1000 | свыше 1000 до 3000 | более 3000 |
Структура печени | не изменена | дискомплексация печёночных балок (+) | дискомплексация печёночных балок (++ и +++) |
Белковая дистрофия | очаговая и диффузная (+) | диффузная, до очаговой гидропической (++) | диффузная гидропическая (+++) |
Жировая дистрофия | очаговая, преимущественно микровезикулярнаяв 1-й зоне ацинусов | очаговая и диффузная, микро- и макровезикулярная во всех зонах ацинусов | диффузная, преимущественно макровезикулярная во всех зонах ацинусов |
Отёк паренхимы | + | ++ | ++ и +++ |
Кровоизлияния | + | ++ | ++ и +++ |
Некрозы | единичные клетки (+) | моноцеллюлярные (++) | моноцеллюлярные (++) и центролобулярные (+++) |
Центральный эндотелиит | + и ++ | ++ и +++ | +++ |
Инфильтрация портальных трактов | Лимфоциты, единичные ПМЯЛ. Воспалительная инфильтрация охватывает меньшую часть триад (+) | Лимфоциты и ПМЯЛ. Воспалительная инфильтрация охватывает большую часть триад (++) | Лимфоциты и ПМЯЛ. Воспалительная инфильтрация охватывает большую часть триад и переходит на перипортальную паренхиму (+++) |
Инфильтрация паренхимы | очаговая, ПМЯЛ (+) | очагово-диффузная, ПМЯЛ (++) | диффузная, ПМЯЛ (+++) |
+ лёгкий, ++ умеренный, +++ тяжёлый |
Заключение
Независимо от выраженности ИКРП морфологические изменения в трансплантатах печени были однотипными и имели характер острого альтеративно-экссудативного воспалительного процесса, что свидетельствует о неспецифическом характере ответа на гипоксию. ИКРП лёгкой степени не влияло на раннюю функцию и прогноз выживания трансплантата печени, умеренное и тяжёлое - всегда сопровождалось обширными некрозами и нейтрофильной инфильтрацией и приводило к выраженной дисфункции органа. Установлено, что наиболее значимыми лабораторными показателями у реципиентов, отражающими тяжесть ИКРП, являются АСТ, АЛТ и ЛДГ. В результате проведённого исследования разработаны морфологические критерии лёгкого, умеренного и тяжёлого ИКРП трансплантированной печени, которые позволяют практическому морфологу чётко интерпретировать данную патологию в материале биоптатов раннего посттрансплантационного периода.
АД | артериальное давление |
АЛТ | аланинаминотрансфераза |
АСТ | аспартатаминотрансфераза |
Γ-ГТП | гаммаглутамил-транспептидаза |
ИВЛ | искусственная вентиляция лёгких |
ИГХИ | иммуногистохимическое исследование |
ИМТ | индекс массы тела |
ИКРП | ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение |
ЛДГ | лактатдегидрогеназа |
НД | неэффективный посмертный донор печени |
ОНМК | острое нарушение мозгового кровообращения |
ОРИТ | отделение реанимации и интенсивной терапии |
ОТП | ортотопическая трансплантация печени |
ПКЦОД | Приволжский Координационный Центр органного и тканевого донорства |
ПМЯЛ | полиморфно-ядерные лейкоциты |
УЗИ | ультразвуковое исследование |
ЦВД | центральное венозное давление |
ЧМТ | черепно-мозговая травма |
ЩФ | щелочная фосфатаза |
ЭД | эффективный посмертный донор печени |